熒光探針法是用序列特異的熒光標(biāo)記探針來檢測(cè)產(chǎn)物，探針法的出現(xiàn)使得定量PCR技術(shù)的特異性比常規(guī)PCR技術(shù)大大提高。目前較常提及的有TaqMan探針、FRET雜交探針（熒光共振能量傳遞探針）和分子信標(biāo)Molecular Beacon。

    廣泛使用的TaqMan探針法是指PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)另外加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)（Reporter，R），如FAM、VIC等，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)（Quencher, Q），如TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，5'端報(bào)告基團(tuán)經(jīng)儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3'端熒光基團(tuán)淬滅，儀器檢測(cè)不到5'端報(bào)告基團(tuán)所激發(fā)的熒光信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5'－3'外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）就會(huì)將切割探針，釋放5'端報(bào)告基團(tuán)游離于反應(yīng)體系中，遠(yuǎn)離3'端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，5'端報(bào)告基團(tuán)受激發(fā)所發(fā)射的熒光信號(hào)就可以被探頭檢測(cè)到。也就是說每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。報(bào)告信號(hào)的強(qiáng)度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。

探針設(shè)計(jì)的基本原則：

（1）保守

    探針要絕對(duì)的保守，有時(shí)分型就單獨(dú)依靠探針來決定。理論上有一個(gè)堿基不配對(duì)，就可能檢測(cè)不出來。若找不到完全保守的片段，也只能選取有一個(gè)堿基不同的片段。且這個(gè)不同的堿基最好在探針的中間，對(duì)探針與目的片段的雜交影響不大，不相同的堿基最好不要在兩端，因?yàn)閮啥瞬焕谔结樀碾s交。且最好為A或T，而不能為G或C，因?yàn)锳、T為雙鍵，而G、C為三鍵。

（2）探針長(zhǎng)度

    Taqman探針的長(zhǎng)度最好在25－32 bp之間，且Tm值在68－72℃之間，最好為70℃，確保探針的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，這樣可保證探針在退火時(shí)先于引物與目的片段結(jié)合。因此探針最好是富含GC的保守片段，保證其Tm值較高?，F(xiàn)在有Taqman MGB探針，在TAMER之后再標(biāo)記一個(gè)MGB，可使探針的Tm值較高，即使探針片段較短，也可達(dá)到Taqman探針的Tm值在68－70℃之間。

（3）探針的名稱

    根據(jù)標(biāo)記探針在基因組的位置及長(zhǎng)度命名。

（4）探針Tm值計(jì)算

    用oligo或primer premier軟件即可計(jì)算Tm值。確保探針中GC含量在30－80%。應(yīng)避免探針中多個(gè)重復(fù)的堿基出現(xiàn)，尤其是要避免4個(gè)或超過4個(gè)的G堿基出現(xiàn)。

（5）探針的評(píng)價(jià)

    用DNAstar軟件中的Primerselect軟件，點(diǎn)擊“l(fā)og”菜單中的“create primer catalog”，在“name”中輸入探針的名稱、位置，按Tab鍵進(jìn)入“sequence”，粘貼或輸入要分析的探針序列。選中整個(gè)序列后，在 “report”菜單下“primer self dimer”，分析探針的二聚體。彈出的窗口中就告訴此探針有多少個(gè)dimer，并對(duì)此探針用dG值進(jìn)行評(píng)價(jià)（通常給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好）。在“report”菜單下“primer hairpins”，分析探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。彈出的窗口中就告訴此探針有多少個(gè)hairpins，并對(duì)此探針的hairpins進(jìn)行評(píng)價(jià)。

（6）探針的5’端

    探針的5’端不能為G，因?yàn)榧词箚蝹€(gè)G堿基與FAM熒光報(bào)告基團(tuán)相連時(shí)，G可以淬滅FAM基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號(hào)，從而導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。

（7）Taqman探針與引物之間的位置

    Taqman探針應(yīng)靠近上游引物，即Taqman探針應(yīng)靠近與其在同一條鏈上的上游引物。兩者的距離最好是探針的5’ 端離上游引物的3’有一個(gè)堿基，但也可以重疊，要保證Taqman探針的5’端離上游引物的5’端至少有4bp。