實(shí)時(shí)熒光定量PCR（SYBR Green染料法，miRNA）

1. 原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)結(jié)合了實(shí)時(shí)定量PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量試劑、通用電腦和自動(dòng)分析軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，使產(chǎn)物的數(shù)量與檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系，從而得出產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線。理想的擴(kuò)增曲線應(yīng)為J型，符合2^N方程(其中N為PCR的循環(huán)次數(shù))，但實(shí)際上擴(kuò)增曲線為S型。在PCR反應(yīng)早期，不能將產(chǎn)生熒光的水平與背景明顯區(qū)別，之后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺(tái)期，因此可以在指數(shù)期的某一點(diǎn)上檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，并由此推斷起始模板含量。

2. microRNA（miRNA）

小分子核糖核酸（microRNA）是進(jìn)化守恒的、小的、非編碼RNA分子，保守估計(jì)至少調(diào)控30%的總蛋白編碼基因。目前有超過(guò)2900個(gè) miRNA已經(jīng)被注釋，包括來(lái)自植物、蠕蟲(chóng)、蒼蠅、哺乳動(dòng)物和病毒等。目前的研究認(rèn)為，miRNA與生物的發(fā)展、分化、細(xì)胞凋亡、脂肪代謝、病毒感染和癌癥息息相關(guān)。

miRNA大小一般在~ 22 nt左右，由于miRNA只代表一小部分的總RNA，檢測(cè)它們是很困難的，利用傳統(tǒng)的PCR方法根本無(wú)法分析。目前已經(jīng)有很多商業(yè)化的試劑盒可以用于miRNA檢測(cè)，其靈敏度高，操作方便。

3. 類(lèi)型

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的常用機(jī)制包括熒光染料檢測(cè)和水解探針檢測(cè)。

4.  SYBR Green I檢測(cè)  

 SYBR GreenI是一種能結(jié)合到dsDNA小溝部位的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料，它只有與dsDNA結(jié)合后才會(huì)發(fā)出熒光。在變性時(shí)，DNA雙鏈分開(kāi)，不產(chǎn)生熒光；在復(fù)性和延伸時(shí)，形成dsDNA，SYBR GreenI發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，直到達(dá)到閾值，被熒光探測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到。因此，熒光強(qiáng)度可以代表擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量。

SYBR Green I的優(yōu)點(diǎn)：

①成本較低，不需合成和標(biāo)記探針；

②適合初步篩查：選用SYBR篩查，再用探針?lè)ň_定量少數(shù)關(guān)鍵樣品。

SYBR Green I的缺點(diǎn)：

①特異性差，不能分辨主帶與雜帶，給出的是總信號(hào)，所以在低樣本濃度時(shí)，不能進(jìn)行基因突變分析。但該方法可利用熔點(diǎn)曲線分析將特異產(chǎn)物、引物二聚體和非特異性產(chǎn)物區(qū)別開(kāi)來(lái)，不需要通過(guò)電泳鑒定；

②不能做多重檢測(cè)，每孔只能檢測(cè)1個(gè)目標(biāo)基因；③靈敏度低，適合于5000拷貝以上的基因定量。

5. 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）樣品RNA的提取

    取新鮮的組織或細(xì)胞（如果不能立即開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，應(yīng)將樣品置于-80℃冰箱保存），加入適量的Trizol裂解液，使組織或細(xì)胞中的內(nèi)容物釋放出來(lái)。采用有機(jī)溶劑氯仿/異丙醇抽提，提取組織或細(xì)胞中的總RNA。

（2）RNA濃度及純度檢測(cè)

    采用瓊脂糖凝膠電泳定性檢測(cè)提取的總RNA的濃度及純度，并且使用Nanodrop 2000測(cè)定RNA濃度和純度。

（3）cDNA第一條鏈的合成

按照說(shuō)明書(shū)的要求在反應(yīng)體系中加入500 ng的總RNA、miRNA RT prime、dNTP Mix、RNase Inhibitor 、RT Enzyme、miRNA RT Buffer，用無(wú)核酸酶ddH₂O補(bǔ)足體積。保證每個(gè)樣品加入的總RNA量相同。然后置于PCR儀中擴(kuò)增合成cDNA第一條鏈。

（4）待測(cè)樣品的管家基因及待測(cè)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)并合成內(nèi)參基因和待測(cè)基因引物。按照說(shuō)明書(shū)要求在反應(yīng)體系中加入SYBR Green Mix、cDNA模版、內(nèi)參基因或待測(cè)基因miRNA上下游引物，用ddH₂O補(bǔ)足體積。然后置于熒光定量PCR儀中，設(shè)置好參數(shù)，進(jìn)行擴(kuò)增。

（5）數(shù)據(jù)處理

觀察擴(kuò)增曲線和溶解曲線，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，計(jì)算樣品Ct值。

6. PCR疑難解答

當(dāng)PCR結(jié)果不甚滿意時(shí)，首先檢查以下幾方面并遵照?qǐng)?zhí)行：

（1）將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼；

（2）當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70℃“熱啟動(dòng)”開(kāi)始循環(huán)時(shí)，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因?yàn)樵?.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱； 

（3）不要隨意減少dNTP的用量，它是一個(gè)系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡；

（4）對(duì)于有問(wèn)題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進(jìn)行預(yù)變性，后加模板進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。

沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物：

（1）在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無(wú)MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；

（2）泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補(bǔ)加MgCl2，因?yàn)樵赑CR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+； 

（3）檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度；

（4）檢查模板和引物的用量；

（5）增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。