熒光探針法是用序列特異的熒光標記探針來檢測產(chǎn)物，探針法的出現(xiàn)使得定量PCR技術(shù)的特異性比常規(guī)PCR技術(shù)大大提高。目前較常提及的有TaqMan探針、FRET雜交探針（熒光共振能量傳遞探針）和分子信標Molecular Beacon。

    廣泛使用的TaqMan探針法是指PCR擴增時在加入一對引物的同時另外加入一個特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點在兩條引物之間。探針的5'端標記有熒光報告基團（Reporter，R），如FAM、VIC等，3'端標記有熒光淬滅基團（Quencher, Q），如TAMRA等。當探針完整的時候，5'端報告基團經(jīng)儀器光源激發(fā)的熒光正好被近距離的3'端熒光基團淬滅，儀器檢測不到5'端報告基團所激發(fā)的熒光信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5'－3'外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）就會將切割探針，釋放5'端報告基團游離于反應(yīng)體系中，遠離3'端熒光淬滅基團的屏蔽，5'端報告基團受激發(fā)所發(fā)射的熒光信號就可以被探頭檢測到。也就是說每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。報告信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數(shù)。

探針設(shè)計的基本原則：

（1）保守

    探針要絕對的保守，有時分型就單獨依靠探針來決定。理論上有一個堿基不配對，就可能檢測不出來。若找不到完全保守的片段，也只能選取有一個堿基不同的片段。且這個不同的堿基最好在探針的中間，對探針與目的片段的雜交影響不大，不相同的堿基最好不要在兩端，因為兩端不利于探針的雜交。且最好為A或T，而不能為G或C，因為A、T為雙鍵，而G、C為三鍵。

（2）探針長度

    Taqman探針的長度最好在25－32 bp之間，且Tm值在68－72℃之間，最好為70℃，確保探針的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，這樣可保證探針在退火時先于引物與目的片段結(jié)合。因此探針最好是富含GC的保守片段，保證其Tm值較高?，F(xiàn)在有Taqman MGB探針，在TAMER之后再標記一個MGB，可使探針的Tm值較高，即使探針片段較短，也可達到Taqman探針的Tm值在68－70℃之間。

（3）探針的名稱

    根據(jù)標記探針在基因組的位置及長度命名。

（4）探針Tm值計算

    用oligo或primer premier軟件即可計算Tm值。確保探針中GC含量在30－80%。應(yīng)避免探針中多個重復的堿基出現(xiàn)，尤其是要避免4個或超過4個的G堿基出現(xiàn)。

（5）探針的評價

    用DNAstar軟件中的Primerselect軟件，點擊“l(fā)og”菜單中的“create primer catalog”，在“name”中輸入探針的名稱、位置，按Tab鍵進入“sequence”，粘貼或輸入要分析的探針序列。選中整個序列后，在 “report”菜單下“primer self dimer”，分析探針的二聚體。彈出的窗口中就告訴此探針有多少個dimer，并對此探針用dG值進行評價（通常給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好）。在“report”菜單下“primer hairpins”，分析探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。彈出的窗口中就告訴此探針有多少個hairpins，并對此探針的hairpins進行評價。

（6）探針的5’端

    探針的5’端不能為G，因為即使單個G堿基與FAM熒光報告基團相連時，G可以淬滅FAM基團所發(fā)出的熒光信號，從而導致假陰性的出現(xiàn)。

（7）Taqman探針與引物之間的位置

    Taqman探針應(yīng)靠近上游引物，即Taqman探針應(yīng)靠近與其在同一條鏈上的上游引物。兩者的距離最好是探針的5’ 端離上游引物的3’有一個堿基，但也可以重疊，要保證Taqman探針的5’端離上游引物的5’端至少有4bp。