shRNA慢病毒表達載體構(gòu)建

1. 簡介

siRNA直接轉(zhuǎn)染細胞可以方便的實現(xiàn)瞬時基因沉默，通常持續(xù)時間在3－7天左右，因目標(biāo)基因差異而定，但是轉(zhuǎn)染效率極低。對于一些半衰期長的蛋白，要想觀察蛋白表達下降對細胞表型的長期影響就需要長期研究目標(biāo)基因沉默的效果，shRNA表達載體是更適合的選擇。

shRNA是short hairpin RNA 的縮寫，翻譯為短發(fā)夾RNA。shRNA包括兩個短反向重復(fù)序列，中間由一莖環(huán)（loop）序列分隔組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由pol Ⅲ啟動子控制。隨后在連上5－6個T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄終止子。攜帶目標(biāo)基因shRNA的表達載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)到目標(biāo)細胞中，載體表達shRNA并被Dicer酶切割為siRNA，從而引發(fā)目標(biāo)基因的沉默。shRNA表達載體可分為質(zhì)粒載體和病毒載體，病毒載體又分為慢病毒載體和腺病毒載體。

慢病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)，但也有不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒的組份和特性，作為基因治療載體發(fā)展起來，最近已用于轉(zhuǎn)基因動物制備。利用慢病毒構(gòu)建的shRNA/miRNA載體，與化學(xué)合成的siRNA和基于瞬時表達載體構(gòu)建的shRNA相比，一方面可以擴增替代瞬時表達載體使用，另一方面，lentivirus－shRNA/miRNA克隆經(jīng)過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細胞系如原代細胞、干細胞、懸浮細胞和處于非分裂狀態(tài)的細胞，并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組，進行長時間的穩(wěn)定表達。

2. shRNA慢病毒表達系統(tǒng)特點

（1）可以大大提高對于一些較難轉(zhuǎn)染的細胞，如原代細胞、干細胞和處于非分裂狀態(tài)細胞等轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；

（2）目的基因整合到宿主細胞基因組的機率大大增加；

（3）能夠插入較大的片段（＞3 kb）；

（4）細胞毒性較低；

（5）能夠用于干細胞研究；

（6）能夠快速獲得高水平的表達。

3. 慢病毒表達系統(tǒng)組成

（1）慢病毒表達載體；

（2）慢病毒包裝質(zhì)粒；

（3）可產(chǎn)生假病毒顆粒的細胞系

4. shRNA慢病毒載體構(gòu)建方法

（1）根據(jù)目的基因相關(guān)信息，利用高效的設(shè)計軟件，設(shè)計shRNA序列，針對每條目的基因，推薦設(shè)計4條shRNA序列，其中一條為陰性對照；

（2）在設(shè)計的siRNA序列中間加入loop序列，兩段經(jīng)過適當(dāng)修飾，加上酶切位點的目的基因序列，根據(jù)設(shè)計好的shRNA，合成兩條互補的短片段DNA；

（3）對合成好的DNA片段進行適當(dāng)稀釋、退火，與線性化的載體（穿梭載體）連接、轉(zhuǎn)化、涂平板、過夜培養(yǎng)；

（4）利用PCR方法進行鑒定，篩選陽性菌落并測序，用測序正確的菌株用于后續(xù)研究；

（5）對于測序正確的菌落，提取和純化高質(zhì)量的不含內(nèi)毒素的shRNA慢病毒穿梭質(zhì)粒；

（6）取穿梭質(zhì)粒和慢病毒表達載體進行重組反應(yīng)，然后進行轉(zhuǎn)化，利用PCR方法進行鑒定，篩選陽性菌落并測序；

（7）將陽性重組載體與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，進行病毒包裝和生產(chǎn)，收集病毒液；

（8）濃縮、純化病毒液，進行滴度測定，要求病毒滴度＞10⁸TU/mL；

（9）濃縮和純化好的shRNA慢病毒表達載體轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)細胞，目的基因進入到宿主細胞后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄整合到宿主基因組上，從而高水平表達效應(yīng)分子。

注意事項： 要求指明基因名稱、種屬、GI號、載體。

慢病毒包裝 腺病毒包裝

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