核酸分離與純化的步驟

大多數(shù)核酸分離與純化的方法一般都包括了細胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質(zhì)分離、核酸純化等幾個主要步驟。每一步驟又可由多種不同的方法單獨或聯(lián)合實現(xiàn)。

1. 細胞裂解:核酸必須從細胞或其他生物物質(zhì)中釋放出來。細胞裂解可通過機械作用、化學(xué)作用、酶作用等方法實現(xiàn)。

(1) 機械作用:包括低滲裂解、超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法。這些方法用機械力使細胞破碎,但機械力也可引起核酸鏈的斷裂,因而不適用于高分子量長鏈核酸的分離。有報道超聲裂解法提取的核酸片段長度從< 500bp ～ > 20kb 之間,而顆粒勻漿法提取的核酸一般< 10kb。

(2) 化學(xué)作用:在一定的p H 環(huán)境和變性條件下,細胞破裂,蛋白質(zhì)變性沉淀,核酸被釋放到水相。上述變性條件可通過加熱、加入表面活性劑(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或強離子劑(異硫氰酸胍、鹽酸胍、肌酸胍) 而獲得。而p H 環(huán)境則由加入的強堿(NaOH) 或緩沖液 ( TE、STE 等) 提供。在一定的p H 環(huán)境下,表面活性劑或強離子劑可使細胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀,緩沖液中的一些金屬離子螯合劑( EDTA 等) 可螯合對核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+ 、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護核酸不被降解。

(3) 酶作用:主要是通過加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶) 以使細胞破裂,核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì),促進核酸的分離。其中溶菌酶能催化細菌細胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1 ,4) 鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵,其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時仍保留酶活性,這有利于提高對高分子量核酸的提取效率。在實際工作中,酶作用、機械作用、化學(xué)作用經(jīng)常聯(lián)合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據(jù)細胞類型、待分離的核酸類型及后續(xù)實驗?zāi)康膩泶_定。

2. 酶處理:在核酸提取過程中,可通過加入適當?shù)拿甘共恍枰奈镔|(zhì)降解,以利于核酸的分離與純化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質(zhì),滅活核酸酶(DNase 和RNase) ,DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸。

3. 核酸的分離與純化:核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等其他生物大分子物質(zhì)更具親水性,根據(jù)它們理化性質(zhì)的差異,用選擇性沉淀、層析、密度梯度離心等方法可將核酸分離、純化。(1) 酚提取/ 沉淀法:核酸分離的一個經(jīng)典方法是酚∶氯仿抽提法。細胞裂解后離心分離含核酸的水相,加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25 ∶24 ∶1 體積) 混合液。依據(jù)應(yīng)用目的,兩相經(jīng)漩渦振蕩混勻(適用于分離小分子量核酸) 或簡單顛倒混勻(適用于分離高分子量核酸) 后離心分離。疏水性的蛋白質(zhì)被分配至有機相,核酸則被留于上層水相。酚是一種有機溶劑,預(yù)先要用STE 緩沖液飽和,因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發(fā)黃,而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián);故在制備酚飽和液時要加入82羥基喹嚀,以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白質(zhì)變性,從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡。核酸鹽可被一些有機溶劑沉淀,通過沉淀可濃縮核酸,改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質(zhì)分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀,在含核酸的水相中加入p H5. 0～5. 5 ,終濃度為0. 3M 的NaOAc 或KOAc 后,鈉離子會中和核酸磷酸骨架上的負電荷,在酸性環(huán)境中促進核酸的疏水復(fù)性。然后加入2～2. 5 倍體積的乙醇,經(jīng)一定時間的孵育,可使核酸有效地沉淀。其他的一些有機溶劑[ 異丙醇、聚乙二醇( PEG) 等]和鹽類(10. 0mol/ L 醋酸銨、8. 0mol/ L 的氯化鋰、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等) 也用于核酸的沉淀。不同的離子對一些酶有抑制作用或可影響核酸的沉淀和溶解, 在實際使用時應(yīng)予以選擇。經(jīng)離心收集,核酸沉淀用70 %的乙醇漂洗以除去多余的鹽分,即可獲得純化的核酸。(2) 層析法:層析法是利用不同物質(zhì)某些理化性質(zhì)的差異而建立的分離分析方法。包括吸附層析、親和層析、離子交換層析等方法在內(nèi)的層析法。因分離和純化同步進行,并且有商品試劑盒供應(yīng),而被廣泛應(yīng)用于核酸的純化。在一定的離子環(huán)境下,核酸可被選擇性地吸附到硅土、硅膠或玻璃表面而與其他生物分子分離。另外一些選擇性吸附方法以經(jīng)修飾或包被的磁珠作為固相載體,磁珠可通過磁場分離而無需離心,結(jié)合至固相載體的核酸可用低鹽緩沖液或水洗脫。該法分離純化核酸,具有質(zhì)量好、產(chǎn)量高、成本低、快速、簡便、節(jié)省人力以及易于實現(xiàn)自動化等優(yōu)點。

玻璃粉或玻璃珠被證實為一種有效的核酸吸附劑。在高鹽溶液中,核酸可被吸附至玻璃基質(zhì)上,離液鹽碘化鈉或高氯酸鈉可促進DNA 與玻璃基質(zhì)的結(jié)合。Dederich 等用酸洗玻璃珠分離純化核酸,獲得高產(chǎn)量的質(zhì)粒DNA。在該方法中,細胞在堿性環(huán)境下裂解,裂解液用醋酸鉀緩沖液中和后,直接加至含異丙醇的玻璃珠濾板,被異丙醇沉淀的質(zhì)粒DNA 結(jié)合至玻璃珠,用80 %乙醇真空抽洗除去細胞殘片和蛋白質(zhì)沉淀。最后用含RNase A 的TE 緩沖液洗脫與玻璃珠結(jié)合的DNA ,獲得的DNA 可直接用于測序。

Elkin 等使用羧化磁珠分離純化質(zhì)粒DNA。該法在細胞裂解后,離心分離含質(zhì)粒的水相,再加入羧化的磁粒,然后用 PEG/ NaCl 沉淀,使目的DNA 吸附至磁珠,最后用磁場分離被吸附的DNA ,經(jīng)乙醇洗滌,用水洗脫,可獲得高產(chǎn)量的適用于毛細管測序的模板DNA。

也有用鐵粒為固相支持物,經(jīng)磁場分離而純化質(zhì)粒DNA 的報道。細菌用溶菌酶2煮沸法裂解,質(zhì)粒被釋放至懸浮液中, 加鐵珠捕獲,用磁場使鐵珠分離,經(jīng)漂洗后用水洗脫質(zhì)粒,可獲得高產(chǎn)量、測序級的質(zhì)粒DNA。

親和層析是利用待分離物質(zhì)與它們的特異性配體間所具有的特異性親和力來分離物質(zhì)的一類層析方法。Chandler 等報道了一種用肽核酸(PNA) 分離核酸的方法。PNA 是一類以 N-(2-氨乙基)2甘氨酸結(jié)構(gòu)單元為骨架的DNA 類似物,可作為純化皮克(pg) 級核糖體DNA ( rDNA) 和核糖體RNA ( rRNA) 的試劑。在該方法中,以生物素標記的肽核酸(peptide nucleic acids ,PNAs) 為探針,以包被了抗生蛋白鏈菌素的磁珠作為固相載體。PNA 探針在高鹽環(huán)境下, 與目的核酸(DNA 或 RNA) 混合,經(jīng)煮沸、冰浴、溫育雜交步驟后,直接加入包被了抗生蛋白鏈菌素的順磁性顆粒,經(jīng)靜置捕獲PNA-核酸雜交體,水洗而獲得純化的核酸。

Schluep 等亦基于親和層析原理,采用一種三螺旋體DNA 的方式進行質(zhì)粒DNA 的分離。三螺旋體DNA 由同質(zhì)嘌呤2 同質(zhì)嘧啶雙螺旋鏈與同質(zhì)嘧啶單鏈組成,單鏈上的T 識別A ·T 堿基,對形成T ·A ·T 三聯(lián)體,質(zhì)子化的單鏈胞嘧啶 (C+ ) 識別G·C 堿基對形成C ·G·C 三聯(lián)體。在適當?shù)臈l件下,三螺旋體的結(jié)合具有高特異性和高穩(wěn)定性。將配體聚嘧啶寡核苷酸鏈通過化學(xué)方法連接至Sephacryl S21000 SF 顆粒上形成親和載體。當含目的序列的質(zhì)粒DNA 溶液與其混合時,在酸性環(huán)境(p H 4. 5～5. 5) 下,質(zhì)粒結(jié)合至親和載體顆粒上,溶液中高濃度的NaCl 可穩(wěn)定三聯(lián)體形式并減少與蛋白質(zhì)、細胞DNA 的非特異性結(jié)合。經(jīng)一段時間反應(yīng)后,顆粒懸浮液被加至一層析柱,用適當?shù)南疵撘焊淖僷 H 值至堿性環(huán)境,可使三聯(lián)體解聚,質(zhì)粒被洗脫。經(jīng)該法分離質(zhì)粒DNA ,質(zhì)粒產(chǎn)量可達到加入量的62 %。

也有用Schizophyllan ( SPG) 制備親和層析柱分離純化 RNA 的報道。SPG是一種β21 ,32葡聚糖,在低溫下,含RNA 的流動相通過層析柱,Poly (C) 和poly (A) 與SPG通過氫鍵和疏水作用形成復(fù)合物而被吸附于柱上,然后通過改變緩沖液成分,將被吸附的RNA 洗脫。親和層析應(yīng)用于核酸分離與純化的另一個例子是用oligo ( dT)2纖維素層析法從真核細胞總 RNA 中分離帶poly (A) 尾的mRNA。在該方法中,短鏈oligo (dT) 通過其52磷酸與纖維素的羥基共價結(jié)合而連接至纖維素介質(zhì)上。當樣本經(jīng)過oligo (dT) 柱時,mRNA 因其poly (A) 可與短鏈oligo (dT) 形成穩(wěn)定的RNA2DNA 雜合鏈,而被連接到纖維素介質(zhì)上,從而與其他RNA 分離。在適當?shù)臈l件下(低鹽、加熱) ,poly (A) RNA 可被水洗脫而得以純化。

離子交換層析以具有離子交換性能的物質(zhì)為固定相,其與流動相中的離子能進行可逆交換,從而能分離離子型化合物。用離子交換層析純化核酸是因為核酸為高負電荷的線性多聚陰離子,在低離子強度緩沖液中,利用目的核酸與陰離子交換柱上功能基質(zhì)間的靜電反應(yīng),使帶負電荷的核酸結(jié)合到帶正電的基質(zhì)上,雜質(zhì)分子被洗脫。然后提高緩沖液的離子強度,將核酸從基質(zhì)上洗脫,經(jīng)異丙醇或乙醇沉淀即可獲得純化的核酸。該法適用于大規(guī)模核酸的純化。Ferreira 等用含0. 5 M NaCl 的TE 緩沖液平衡層析柱,加樣后用含1 M NaCl 的TE 緩沖液洗脫核酸,獲得了很好的分離效果。

(3) 密度梯度離心法:密度梯度離心也用于核酸的分離和分析。雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA 和蛋白質(zhì)具有不同的密度,因而可經(jīng)密度梯度離心形式形成不同密度的純樣品區(qū)帶, 該法適用于大量核酸樣本的制備,其中氯化銫2溴化乙錠梯度平衡離心法被認為是純化大量質(zhì)粒DNA 的首選方法。氯化銫是核酸密度梯度離心的標準介質(zhì),梯度液中的溴化乙錠與核酸結(jié)合,離心后形成的核酸區(qū)帶經(jīng)紫外燈照射,產(chǎn)生熒光而被檢測,用注射針頭穿刺回收后,通過透析或乙醇沉淀除去氯化銫而獲得純化的核酸。

展望

隨著“后基因組時代”的來臨,毛細管電泳等快速、高效的技術(shù)方法已廣泛應(yīng)用于核酸分析。以前一些傳統(tǒng)的核酸提取方法因操作繁瑣、提取效率低、費時費力或使用有毒的化學(xué)試劑且不易于實現(xiàn)自動化儀器操作等原因,已不適應(yīng)分子生物技術(shù)的發(fā)展要求。隨著人們的努力和技術(shù)的進步,相信一定會出現(xiàn)更多簡便、安全、高效、低成本且適用于自動化儀器操作新的核酸分離與純化方法,從而更快地推動分子生物學(xué)的發(fā)展。